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曲妥珠單抗LC-MS/MS定量分析方法開發(fā)

點擊次數(shù)：5335  更新時間：2017-01-19
　　曲妥珠單抗是一種抗 Her2 的重組 DNA 衍生的人源化單克隆抗體，它通過將自己附著在 Her2 上來阻止人體表皮生長因子在 Her2 上的附著，從而阻斷癌細胞的生長，曲妥珠單抗還可以刺激身體自身的免疫細胞去摧毀癌細胞。隨著曲妥珠單抗在臨床的廣泛應(yīng)用，對該藥物在人體血漿中定量檢測的精密度和準確度要求也日益提高。
 
　　隨著液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)以及生物樣品分離技術(shù)的發(fā)展，LC-MS/MS 定量技術(shù)在蛋白質(zhì)定量研究中的應(yīng)用日益廣泛。相對于傳統(tǒng)的免疫分析方法(例如 ELISA)，LC-MS/MS定量技術(shù)提高了蛋白分析的精密度和準確度?；谫|(zhì)譜法的蛋白定量在抗體藥物臨床前及臨床研究中受到越來越多的關(guān)注，為了使蛋白質(zhì)定量技術(shù)與藥物研究和臨床檢驗更加緊密結(jié)合，島津公司將其超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺和強大的定量蛋白質(zhì)組學(xué)軟件 Skyline集成一體。根據(jù)蛋白質(zhì)序列和用戶自定義，Skyline 軟件可以用來設(shè)計、改善以及優(yōu)化選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)/多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、全掃描質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜定量法。Skyline 軟件不僅將結(jié)果和方法優(yōu)化結(jié)合起來，也為蛋白質(zhì)定量的研究工作提供了標準化的工作流程。同時島津研發(fā)工程師們?yōu)楹喕瘡?fù)雜生物基質(zhì)中抗體藥物的定量分析工作，對抗體藥物前處理過程進行了*的設(shè)計，發(fā)明了 nSMOL 前處理試劑包，該方法能夠有效富集血漿/血清中的抗體藥物，實現(xiàn) Fab 區(qū)域的選擇性酶解，提高酶解效率，極大降低了酶解產(chǎn)物的復(fù)雜性，對于
 
　　復(fù)雜生物基質(zhì)中抗體藥物的準確定量提供了非常有利的工具。
 
　　本文建立了一種使用島津超液相色譜儀 LC-30A 和三重四極桿質(zhì)譜儀 LCMS-8060與Skyline軟件聯(lián)用建立血漿中曲妥珠單抗定量分析的工作流程。結(jié)合nSMOL前處理技術(shù)，實現(xiàn)抗體藥物 Fab 區(qū)域選擇性酶解，從而顯著降低了方法開發(fā)的復(fù)雜程度。在本實驗篩選階段，共有 10 個肽段具有明顯的色譜峰，其中 8 條肽段與曲妥珠單抗的 Fab 區(qū)域相關(guān)，而曲妥珠單抗具有代表性的特異性肽段集中于 Fab 區(qū)域，充分體現(xiàn)了 nSMOL 技術(shù)的高選擇性，從而極大地降低了酶解產(chǎn)物的復(fù)雜性，提高方法開發(fā)的速度。實驗通過 Skyline 軟件完成MRM 通道的設(shè)計和方法的輸出，LabSolutions 基于 Skyline 導(dǎo)出的 MRM 分析方法，進行肽段篩選、碰撞能量優(yōu)化，zui終確認曲妥珠單抗的特征肽段及其對應(yīng)的 MRM 離子對?；谝陨纤⒌姆椒?，本文完成血漿中曲妥珠單抗藥物的定量分析方法開發(fā)，定量特征肽段為IYPTNGYTR(542.80>404.70)，線性范圍為 0.122 μg/mL~125 μg/mL。
 
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